Zawartość białka zmierzono za pomocą testu z kwasem bicynchoninowym (Pierce). Do testu immunoprecypitacji próbki surowicy inkubowano w rozcieńczeniu 1: 100 z 12,5 ng homodimerycznej rekombinowanej ludzkiej osteoprotegeryny (R & D Systems) i agarozowych pereł powlekanych białkiem G (Calbiochem), które wstępnie inkubowano z 5% albuminy w celu zmniejszenia nieswoistego wiązania. Po inkubacji przez godzinę w 37 ° C, kulki przemyto pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, zawieszono w 30 .l redukującego buforu do próbek i inkubowano w 90 ° C przez 5 minut. Po krótkim odwirowaniu supernatant naniesiono na 12% żel poliakrylamidowy (Criterion, Biorad), poddano elektroforezie przy 200 V przez 60 minut, przeniesiono na membranę i sondowano mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko ludzkiej osteoprotegerynie (Abcam). Do wykrywania zastosowano przeciwciało skierowane przeciwko peroksydazie przeciw ospie (Jackson) w rozcieńczeniu 1: 5000. Załadowanie oceniano przez sondowanie blot kozim przeciwciałem skoniugowanym z peroksydazą (Jackson) w rozcieńczeniu 1: 5000. Znakowane immunologicznie prążki wykrywano za pomocą chemiluminescencyjnego substratu (SuperSignal, Pierce) i obrazowania chemiluminescencyjnego (GeneGnome, Syngene). RANK Signaling Assay
Badaliśmy działanie immunoglobulin oczyszczonych z próbek surowicy pobranych od pacjenta i kontrolnych z użyciem kolumn z wirusem białka G (Pierce), na indukowanej przez RANKL aktywacji NF-.B. W tym teście wykorzystano ludzką linię komórek zarodkowo-nerkowych HEK293, stabilnie transfekowaną reagującym na NF-.B wektorem reporterowym lucyferazy (Cambridge Biosciences). Komórki HEK293 utrzymywano w pożywce Eagle a zmodyfikowanej przez Dulbecco uzupełnionej 10% płodowo-cielęcą surowicą i higromycyną (Roche), ale głodzono je przez 2 godziny przed stymulacją, a następnie utrzymywano w pożywce Eagle a z dodatkiem 2% pożywki do hodowli ludzkich tkanek Dulbecco (MP Biomedicals) tworzą bez cytokin. Komórki stymulowano za pomocą ludzkiego rekombinowanego RANKL (100 ng na mililitr) przez godzinę w 37 ° C w obecności osteoprotegeryny (100 do 400 ng na mililitr, systemy R & D) oraz w obecności lub nieobecności immunoglobulin w Rozcieńczenie 1:40. Komórki następnie poddano lizie i lizaty analizowano pod kątem aktywności lucyferazy za pomocą odczynnika Steady-Glo (Promega) na czytniku mikropłytek (Synergy HT, Biotek). Wszystkie testy reporterowe przeprowadzono z pięcioma powtórzeniami na 96-studzienkowej płytce zawierającej 5 x 104 komórek na studzienkę.
Wyniki
Figura 3. Figura 3. Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy przeciwko osteoprotegerynie (OPG) i ich wpływ na aktywację czynnika jądrowego .B (NF-.B) przez receptorowy aktywator ligandu NF-.B (RANKL). Panel A pokazuje obecność autoprzeciwciał przeciwko OPG (u góry) w próbce surowicy pacjenta (linia 2), odzwierciedlonej przez wykrywanie silnego prążka o około 55 kD (strzałka) na analizie Western z przeciwciałem anty-OPG po immunoprecypitacji. . Markery o masie cząsteczkowej 80, 60 i 50 kD pokazano na ścieżce M. Próbki od zdrowych osób kontrolnych (ścieżki 3 i 4) i pacjentów z pierwotną niedoczynnością tarczycy (ścieżki 5 do 8) były ujemne dla autoprzeciwciał, podobnie jak kontrola negatywna. (linia 1) i 12 z 15 próbek od pacjentów z celiakią (przykład pokazano na linii 9)
[przypisy: forum kulturystyczne, wkładki ortopedyczne, ortopeda warszawa ]
Powiązane tematy z artykułem: forum kulturystyczne ortopeda warszawa wkładki ortopedyczne